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    反應器培養CHO細胞表達一種融合蛋白
    時間:2021-10-08 06:04:55
    一、實驗背景
    搖瓶培養:玻璃三角瓶內傳代培養,30ml搖瓶接種密度是:0.8×10E6 cells/ml,傳代時間兩天左右
    搖瓶產量:密度每天倍翻,一般長到在4-6×10E6,30ml,最高長到6-8×10E6,表達量200-300ug/ml左右,擴大體積培養后蛋白產量下降。
    二、培養條件(實際操作中的控制參數)
    設備型號:BioWill™Lab-5L生物反應器             
    細胞名稱(注明來源):CHO工程細胞,自己轉染構建的
    蛋白名稱(注明胞內或分泌):一種融合蛋白,胞外分泌型
    接種細胞數:0.8×10E6 cells/ml,1000ml
    細胞生長期培養液(糖含量):HyQ SFM4CHO,6.74g/L
    接種后細胞維持培養液:
    細胞生長期DO:50%                     
    細胞生長期pH : 7.2               
    細胞生長期T:37℃                      表達期T:34℃
    轉速度:60rpm
    細胞培養期:  共6天
    表達培養期:共4天
    收獲體積:3L
    三、簡述過程
       接種過程:準備好細胞種子密度為0.8×10E6 cells/ml,活率90%,1000ml打入接種瓶內,置于37度培養箱內。在層流罩連上接種瓶打入種子細胞,留少許檢菌,設置好參數,啟動自動運行狀態,每天根據細胞密度、殘糖量、滲透壓補加培養基、濃縮液和堿。
       表達過程:到后期,細胞密度和體積到達要求后,降溫轉表達。
    四、培養的耗糖檢測:
     
    培養時間/d
    體積/ml
    糖耗g/L/24h
    備注/ml
    1
    500
    0
    接種
    2
    1000
    1.43
    補500培養基
    3
    1100
    1.69
    補堿100
    4
    2100
    2.22
    補1000培養基
    5
    2600
    2.91
    補500培養基
    6
    2700
    3.37
    補堿100
    7
    2700
    3.55
    降溫到34度
    8
    2850
    3.44
    補100濃縮液、堿50
    9
    2950
    3.50
    補100濃縮液、堿50
    10
    3000
    3.34
    收獲
     
    耗糖曲線圖(附上曲線圖):
     
    五、蛋白表達檢測:
    1、每天取樣后做ELISA檢測蛋白表達曲線如下
     
    六、實驗總結與分析(實驗中出現的問題及解決方法)
    1、細胞培養過程中每天取樣,觀察細胞狀態,檢測殘糖及滲透壓,計數及活率,根據細胞密度及耗糖補加培養基和濃縮液。細胞增殖正常,活率正常。
    2、蛋白表達伴隨整個細胞生長過程,當活率低于80%時收獲下罐,以免其他代謝雜質增多不利于后期蛋白分離純化。
    3、在生物反應器上擴大培養后,細胞達到體積大規模的同時密度明顯提高,且工藝參數(相比于搖瓶)控制更穩定,表達量也能明顯提高。
    4、后期補加的培養基及濃縮包,由于配制放置時間過久,可能多肽及谷氨酰胺等營養物質有部分分解,導致影響后期細胞生長及蛋白表達,存在進一步優化工藝的空間。
    七、客戶意見(針對產品或需要改進的地方)
    1、滿意。
    2、由于客戶工藝信息需要保密,部分數據刪除,本總結僅做工藝分析總結用。

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