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    細胞培養工藝如何有效地進行放大

    時間是:2021-10-26 16:40:00 點擊次數:1381
     隨著抗體藥物領域的高速發展,動物細胞培養工藝也在不斷的更新和優化,培養規模更是從早期的百升級別擴大到萬升級別??贵w藥物的生產工藝如果從細胞復蘇開始計算,細胞不斷培養和擴增階段占據了整個流程的大部分時間。因此,細胞培養工藝的優劣是抗體生產中最關鍵的因素之一。

    抗體藥物通過QbD的方法進行生產上游工藝的開發,利用實驗設計(DoE)和高通量平行生物反應器等技術、設備的優勢,高效的完成抗體實驗室規模的研發工藝,盡早了解產品關鍵質量屬性(CAQs)和關鍵工藝參數(CPP)之間的關系,以及確定研發工藝中的設計空間(Design Space)。一旦完成這些小規模研發工藝后,接下來就需要進行工藝的放大。理想情況下,高效的工藝放大能在2-4個月內完成從研發規模到中試/生產規模的過渡。如何實現高效的工藝轉移和放大,是對整個工藝技術團隊經驗和水平嚴峻的考驗。
    工藝放大的目標是在細胞培養規模逐漸擴大的情況下,保證細胞在相對恒定的環境中穩定的生長以進行產物的表達。衡量的標準包括細胞密度、生長速率、活率、產物表達率和糖基化水平等多方面。在細胞培養工藝的放大過程中關鍵控制參數會分為兩種類型。一種是和體積無關的,例如溫度、DO和pH等。另一種是受體積和幾何尺寸影響的,例如攪拌速度和通氣流量等。由于在研發階段使用的罐體供應商多種多樣,罐體的材質(一次性或玻璃)、高徑比、攪拌槳直徑和罐徑比以及放大后使用的罐體一般都不完全一致;甚至同一供應商不同體積的罐體也不能做到等比例尺寸放大。這就給放大后攪拌、通氣等參數的確定帶來很大的挑戰。為保持培養環境的一致性,開發人員通常會采用以下幾種放大準則。

    1. 恒定葉端速度(Tip Speed)

    細胞培養工藝中,攪拌槳剪切力是需要考慮的重要因素之一。不同的工程細胞株對剪切力的耐受能力不同。早期CHO細胞耐受的剪切力較低,現階段的工程細胞株對剪切力的耐受得到很大的提升。剪切力往往通過葉端速度來體現。攪拌槳直徑和轉速決定葉端速度的大小。由于罐體設計的需要,罐體體積的增加,攪拌槳直徑也會增加。因此恒定葉端速度的模式下,大體積罐體的攪拌速度要低于小體積。恒定葉端速度的放大可以讓細胞在同樣的剪切力環境下生長。這種放大策略適用于小規模的放大和生產。

    2. 恒定混勻時間(Mixing time)

    混勻時間是比較簡單的一個放大準則。尤其在化工行業,混勻時間的恒定可以直接作為放大的依據。但在細胞培養工藝中,小規模(如2L以下)體積可以很快達到混勻時間,而大體積則需要更高的葉端速度才能達到混勻時間。這就會導致剪切力的提高,造成細胞的損傷。

    3. 恒定KLa

    KLa是表征氧氣從氣相進入到液相的速率。反應器中合適的KLa是工藝放大的關鍵,O2作為細胞的重要營養物質,影響細胞的正常生長及代謝。恒定的KLa放大準則給細胞提供了相同的氧傳遞環境。但KLa的測定受很多因素影響。例如培養過程中攪拌速度、通氣流量等,需要很多測試和分析來確定合適的KLa。在實際操作過程中,KLa隨著工作體積的增加而增加。當達到一定體積后,KLa CO2又會和KLa相互影響,提高了KLa恒定放大難度。
     
     
    4. 恒定單位體積功耗比(P/V)

    P/V和攪拌功率(Np,Power Number)、罐體直徑、攪拌槳直徑、工作體積、液體密度等很多因素有關,一定程度上體現了混合程度,影響培養體系的混合和傳質。因此恒定P/V被推薦為很多工藝放大的準則,是當前最常采用的放大策略??紤]到細胞剪切力的耐受性不同,常見的P/V范圍在10-40 W/m3。
    影響P/V值的諸多因素

    除以上4個放大依據外,放大到一定體積的規模時,還需要考慮pCO2對細胞生長和蛋白表達的負面影響。小體積培養時,由于通入的氣體在上升過程中可以帶走大部分細胞代謝產生的CO2,基本不用考慮CO2去除(CO2 Stripping)。而大體積培養中, kLa CO2隨著反應器規模的擴大降低,即CO2去除能力降低。體系中氣體飽和度和氣泡量直接影響CO2去除,提高通氣量及氣泡停留時間可以加快移除。部分反應器供應商將CO2去除功能整合進控制系統,方便對pCO2的控制。
     
    無論哪一種放大策略,在使用過程中都會涉及攪拌速度、通氣流量等在不同工作體積下的換算。這需要耗費開發人員大量的時間和精力。某些品牌的生物反應器控制系統,為減少工藝開發中恒定葉端速度和恒定P/V策略的參數換算,直接加入放大助手(Scale-up Assist)軟件。軟件數據庫包含了罐體體積,以及相關葉端速度、P/V值和對應攪拌、氣體流量等的關系。同時也可以自定義輸入其他供應商的參數,用于相互換算。這樣的設計,減少了單一供應商或者多品牌供應商在罐體參數換算過程中的 技術障礙,極大地簡化了用戶在Scale-up,甚至Scale-down開發中的工藝流程。
     
    抗體工藝技術的不斷提升,工藝放大面臨的挑戰也在不斷變化。很多時候需要工藝開發人員根據細胞株特性的不同、表達的產物的不同靈活的調整放大工藝。更多的時候會綜合考慮P/V、葉端速度、CO2去除等多種因素,在確保CQAs的情況下,得到最佳的放大生產工藝。

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